ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СУБЪЕДИНИЦ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ E.coli (Eσ70) И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПРОМОТОРОВ РАННИХ ГЕНОВ ДНК ФАГОВ Т4 И Т7.

Камзолова С.Г., Сорокин А.А., Джелядин Т.Р., Иванова Н.Н., Полозов Р.В.

(Пущино)

Показано дифференцированное действие rpoB403 и rpoB409 мутаций на промоторную специфичность РНК-полимеразы. Константа связывания (К_в) А3 промотора с rpoB403 РНК-полимеразой вдвое больше, чем с ферментом дикого типа. В отличие от этого, rpoB409 мутация влияет на кинетические параметры комплексообразования РНК-полимеразы с D промотором, но не с А3 промотором. Проведен анализ распределения электростатического потенциала вокруг фрагментов ДНК, содержащих промоторы ДНК фагов Т4 и Т7. Полученные результаты свидетельствуют о наличии характеристических элементов в профилях электростатического потенциала промоторной ДНК, специфических для групп промоторов, отличающихся по их ответу на rpoB403- и rpoB409-мутационные изменения β-субъединицы РНК-полимеразы.

DOMAIN ORGANIZATION OF RNA-POLYMERASE SUBUNITS AND GENE ACTIVITY REGULATION OF DNA FROM T4 AND T7 PHAGES.

Kamzolova S.G., Sorokin A.A., Dzhelyadin T.R., Ivanova N.N., Polozov R.V.

(Pushchino)

A differential effect of rpoB403 and rpoB409 mutations on promoter specificity of RNA polymerase was observed. The value of K_B for complex formation of A3 promoter with the rpoB403 mutant RNA polymerase was more than with the normal enzyme by a factor of 2. By contrast, rpoB409 mutation affects the kinetic characteristics of complex formation of the enzyme with D promoter of T7 DNA but not with A3 promoter. The analysis of electrostatic potential distribution around DNA fragments containing promoters of early genes of T4 DNA and T7 DNA was performed. The data obtained point to the existence of some specific elements in the profiles of electrostatic potential distribution of promoter DNA which are typical for promoter groups differing by their functional response to rpoB403- or rpoB409-mutational changes in RNA polymerase β-subunit.

Согласно современной концепции в РНК-полимеразе могут формироваться альтернативные промоторсвязывающие центры, каждый из которых взаимодействует со своей группой промоторов (1). Одним из наиболее перспективных подходов в поиске и идентификации альтернативных структурных элементов фермента, участвующих во взаимодействии с разными промоторами, является использование мутантных форм РНК-полимеразы с измененными регуляторными свойствами (2). Использование такого рода мутантных РНК-полимераз позволяет также проводить классификацию промоторов, выделяя среди них группы, различающиеся по характеру взаимодействия с РНК-полимеразой. Это, в свою очередь, дает возможность осуществлять поиск неканонических промоторных детерминант, специфических для определенных групп промоторов, вовлеченных во взаимодействие с альтернативными структурными элементами промоторсвязывающего центра РНК-полимеразы.

В данной работе было изучено влияние двух оригинальных мутаций–rpoB403 и rpoB409, локализованных в разных доменах β-субъединицы РНК-полимеразы (3,4), на промоторную специфичность фермента. Ранее было показано, что обе мутации оказывают дифференцированное влияние на селективность синтеза РНК при использовании в качестве матриц ДНК фагов Т4 и Т7, причем характер изменения специфичности транскрипции отличается у этих мутантных форм РНК-полимеразы (2-4). Используя различные подходы, позволяющие осуществлять селективную инициацию синтеза РНК с индивидуальных промоторов в составе интактной матрицы Т7-ДНК, было найдено, что rpoB403 мутация не влияет на эффективность утилизации ферментом промоторов А1, А2 и D, однако, увеличивает эффективность синтеза РНК с А3 промотора (2,3). С другой стороны, rpoB409 мутация увеличивает синтез РНК с D промотора, не оказывая при этом никакого влияния на эффективность транскрипции с А1, А2 и А3 промоторов (4). Это позволило выдвинуть А3, D и А1 промоторы в качестве возможных репрезентативных промоторов разных классов, отличающихся по характеру взаимодействия с РНК-полимеразой.

В данной работе определено влияние rpoB403 мутации на кинетические параметры комплексообразования РНК-полимеразы с А1 и А3 промоторами Т7-ДНК, представляющими разные классы. Полученные результаты приведены в таблице.

Можно видеть, что rpoB403 мутация избирательно влияет на взаимодействие РНК-полимеразы с А3 промотором, увеличивая вдвое константу равновесной ассоциации К_В этого комплекса. Как было показано ранее, rpoB409 мутация приводит к значительному увеличению К_В в случае комплексообразования фермента с D промотором и практически не влияет на кинетические параметры взаимодействия РНК-полимеразы с А1 промотором (4).

Таблица. Влияние rpoB403 мутации на кинетические параметры взаимодействия РНК-полимеразы с А1 и А3 промоторами Т7-ДНК.

Фермент	Промотор	КВ(М^-1)	k2(s^-1)
E.coli W12	A1 A3	4.0´10^8 1.8´10^8	6.0´10^-3 10.8´10^-3
rpoB403	A1 A3	3.6´10^8 3.8´10^8	6.9´10^-3 8.1´10^-3

Таким образом, вместе эти данные свидетельствуют о том, что rpoB403 мутация затрагивает активный центр фермента, участвующий во взаимодействии с промоторами, относящимися к типу А3 промотора, в то время как структурный элемент, содержащий rpoB409 мутацию, принимает участие в формировании промоторсвязывающего центра, взаимодействующего с промоторами типа Т7 D.

Анализ нуклеотидных последовательностей D, А3 и А1 промоторов не выявил каких-либо характеристических особенностей в канонических участках этих промоторов, которые могли бы быть причиной различий в характере их взаимодействия с РНК-полимеразой.

Недавно нами было показано, что в качестве новых неканонических промоторных детерминант, специфических для отдельных групп промоторов, может быть профиль распределения электростатического потенциала вокруг промоторной ДНК (5).

С целью поиска специфических промоторных детерминант, характерных для промоторов D, А3 и А1, были проведены расчеты распределения электростатического потенциала вокруг фрагментов ДНК, содержащих эти промоторы. Полученные результаты указывают на наличие нескольких специфических элементов в профилях распределения электростатического потенциала промоторных ДНК, которые отличаются по своему характеру у этих трех промоторов. Параллельно было определено распределение электростатического потенциала для 28 фрагментов ДНК, содержащих различные промоторы ранних генов фага Т4. Было выявлено 5 промоторов Т4 фага – 144.5; 54.0; 158.7 и 73.0, которые имеют сходные профили распределения электростатического потенциала с D промотором Т7 ДНК в области –90 – +1 н.п., и 3 промотора Т4 ДНК – 164.5; 40.4 и 69.9, которые похожи с D промотором в области -140 – -50 н.п. Кроме того, было выявлено 2 промотора Т4 ДНК похожих по топологии распределения электростатического потенциала на А3 промотор в области 140 - –50 н.п. Для ряда промоторов в этих группах полученные биохимические данные свидетельствуют о корреляции между электростатическими свойствами промоторов и их функциональным поведением, в частности, их ответом на rpoB403 и rpoB409 мутации.

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант 99-04-48177).

Список литературы:

1. Камзолова С.Г., Биохимия, 60, 387-394, 1995

2. Камзолова С.Г., Биохимия, 61, 1483-1488, 1996

3. Камзолова С.Г., Иванова Н.Н., Сорокин А.А., Камзалов С.С., Доклады Академии Наук, 372, 257-259, 2000

4. Ozoline O.N., Uteshev T.A., Masulis I.S., Rfvzolova S.G., Biochim. Biophys. Acta, 1172, 251-261,1993

5. Kamzolova S.G., Sivozhelezov V.S., Sorokin A.A., Dzhelyadin T.R., Ivaniva N.N., Polozov R.V., J. Biomolec. Struct. Dyn., 18(3), 325-334, 2000